TUGAS MIKROBIOLOGI

JENIS-JENIS UJIBIOKIMIA

OLEH:

DESY SUSILAWATI MS

G1A007008

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS MATARAM

2009

JENIS-JENIS UJI BIOKIMIA

Metabolisme merupakan suatu transformasi terkendali di dalam sel dan merupakan reaksi-reaksi kimia . Metabolisme menghasilkan energi yang diperlukan untuk mempertahankan kehidupan organisme tersebut. Proses metabolisme dibedakan menjadi dua jenis yaitu anabolisme dan katabolisme. Anabolisme (Biosintesis) yaitu reaksi biokimia yang menyusun molekul-molekul sederhana menjadi molekul-molekul  yang lebih kompleks. Misalnya pembentukkan protein dari asam amino. Secara umum proses anabolik membutuhkan energi. Sedangkan katabolisme yaitu reaksi biokimia yang memecah atau menguraikan molekul-molekul  kompleks menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana. Proses katabolik melepaskan energi yang dibutuhkan oleh sel.

Metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Untuk mengidentifikasi suatu mikrorganisme dilakukan uji biokimia untuk mengetahui aktivitas metabolisme mikroorganisme. Uji biokimia ini mencakup uji fermentasi karbohidrat, uji hidrolisis pati (amilolitik),uji lipolitik uji methyl red, uji Voges-Proskauer , uji oksidase,  uji katalase, uji indol, uji sitrat, uji proteolitik, uji urease, uji hidrogen sulfida (H₂S), uji selulase dan  uji protease.

1.    Uji Lipolitik

1.1. Dasar teori

Lemak atau lipida di satu sisi merupakan komponen membran sitoplasma dan dinding sel, di sisi lain berfungsi sebagai cadangan. Lemak mikroba terutama terutama terdiri dari asam lemak rantai panjang jenuh dan asam lemak dengan satu ikatan tidak jenuh, terutama lipida kompleks  yang terdiri dari gliserin, yang dua gugus dua gugus hidroksinya teresterifikasi dengan asam-asam lemak dan gugus hidroksi ke-3 dengan gugus fosfat atau gula. Sifat fosfat dihubungkan lagi dengan serin , etanolamina atau gliserol. Termasuk dalam lipida ini adalah fosfatidilinosit, fosfatidilgliserin, dan fosfatidiletanolamina yang ditemukan pada sejumlah sel bakteri. Pada mikroba untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Terdapat berbagai cara untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar, Rodhamine Agar dan Spirit Blue Agar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak.

2.2 Cara Kerja :

· Inokulasikan bakteri misalnya bakteri Bacillus sp. pada media Tributyrin Agar dengan indikator neutral red

· Inkubasi pada suhu 37^oC selama 48 jam.

        Pembacaan hasil

Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah

2.    Uji Fermentasi Karbohidrat (uji gula-gula)

2.1. Dasar teori

Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses pengubahan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikrobia pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).

 Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antara lain , sukrosa, laktosa, maltosa dan manitol. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap pertama sedangkan sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa akan dihidrolisis terlebih dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan glukosa. Sukrosa dihidrolisis menjadi glukosa dan fruktosa. Manitol diubah menjadi manosa atau galaktosa. Sedangkan maltosa akan dihidrolisis menjadi dua molekul glukosa.

     + H₂O  +

   Maltosa                                                       glukosa    +      glukosa 

Hidrolisis maltosa (Nelson et al., 2006).

                             Reaksi perubahan manitol  menjadi manosa

Monosakarida jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa melalui reaksi epimerisasi . Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat  dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6- fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO₂ dan kemudian pada tahap kedua fermentasi  asam piruvat dan asam asetat direduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk asam laktat dan etanol.

2.2 Cara kerja

1. menyiapkan nutrient karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol masing-masing 1%. Kaldu karbohidrat yang mengandung BTB (brom timol biru) sebagai indikator pH.

2. ditambahkan pepton sebagai sumber nitrogen, vitamin dan mineral dimasukkan dalam tabung reaksi yang dilengkapi tabung Durham.

3. diinokulasi dengan biakan bakteri.

4.diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30^oC selama 24 jam.

5.  fermentasi karbohidrat diperiksa dengan melihat pembentukan asam (warna kuning) dan pembentukan gas dalam tabung Durham

2.3. Pembacaan hasil

Pembacaan hasil untuk masing-masing uji yaitu:

                   

Jenis Uji	Negatif	Positif
a. Fermentasi glukosa	warna kaldu tetap dan tidak timbul gas pada tabung Durham.	warna kaldu berubah menjadi kuning terang dan timbul gas pada tabung Durham.
b. Fermentasi manitol	warna kaldu tetap dan tidak timbul gas pada tabung Durham.	warna kaldu berubah menjadi kuning dan timbul gas pada tabung Durham.
c. Fermentasi sukrosa	warna kaldu tetap dan tidak timbul gas pada tabung Durham.	warna kaldu berubah menjadi kuning terang dan timbul gas pada tabung Durham.
d. fermentasi laktosa	warna kaldu tetap dan tidak timbul gas pada tabung Durham.	warna kaldu berubah menjadi kuning terang dan timbul gas pada tabung Durham.
e. Fermentasi maltosa	warna kaldu tetap dan tidak timbul gas pada tabung Durham.	warna kaldu berubah menjadi kuning terang dan timbul gas pada tabung Durham.

Dalam uji fermentasi apabila bakteri tersebut mampu memecahkan jenis-jenis karbohidrat tersebut (glukosa, manitol, sukrosa, laktosa, dan maltosa) apabila warna kaldu berubah menjadi berwarna kuning artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi karbohidrat dan terbentuknya gelembung gas pada tabung Durham yang artinya hasil fermentasi berbentuk gas sedangkan

3. Uji Triple Sugar Iron Agar

3.1. Dasar Teori

TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae, yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H₂S pada tabung reaksi. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat, media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%, dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1%. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam, sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Warna media mula-mula adalah merah-orange. Selain itu ditambahkan FeSO₄ untuk mendeteksi adanya gas H₂S.

3.2.Cara kerja

Adapun cara kerja yang dilakukan untuk melakukan uji TSIA yaitu :

· diinokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar).

· diinkubasi pada 37^oC selama 24-48 jam.

3.3.Pembacaan hasil

► slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas H₂S hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.

►slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas H₂S hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.

►slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas  telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam.

►butt berwarna kehitaman adanya H₂S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO₄ pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-hitaman. H₂S ini merupakan hasil dari metabolisme protein. Media pecah atau terangkat, timbul gas sebagai hasil samping fermentasi.

4. uji Voges-Proskauer  

4.1 Dasar Teori

Uji Voges-Proskauer digunakan untuk membedakan antara organisme yang menghasilkan asam dalam jumlah yang besar dan yang menghasilkan produk netral seperti asetilmetilkarbinol (asetoin) dari hasil metabolisme glukosa.  Produk netral ini membuat bakteri dapat memfermentasi karbohidrat dalam jumlah yang besar. Adanya kandungan asetoin yang diproduksi dalam larutan ditandai dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi merah muda hingga merah Uji ini juga digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang dapat memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama, dan akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan α-naftol dalam etanol dapat menentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbinol) yakni suatu senyawa awal dalam sintesis2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan α-naphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal tersebut maka tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja.

4.2. Cara kerja

Ø  Media MR-VP sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi

Ø  diinokulasi bakteri pada kaldu MR-VP

Ø   diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 jam.

Ø  ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes larutan α-naftol, dikocok dan dibiarkan 30 menit.

4.3 Pembacaan Hasil

 Uji positif jika kaldu berwarna merah dan uji negatif jika kaldu tidak mengalami perubahan warna setelah penambahan reagen.

5. Uji methyl red

5.1 Dasar Teori

Uji methyl red (MR) dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat membentuk asam campuran dan asam yang sedemikian banyaknya sehingga dapat mengubah indikator metil merah menjadi merah. Beberapa jenis bakteri dapat membentuk asam tetapi tidak cukup banyak untuk dapat mengubah warna indikator. Bakteri seperti Escherichia coli dapat memberikan hasil pengujian positif karena dapat menurunkan pH sampai di bawah 5,0. Sebaliknya Klebsiella aerogenes mengadakan dekarboksilasi dan kondensasi asam piruvat untuk membentuk asetilmetilkarbinol, sehingga pH meningkat, dan bila ditambahkan metil merah warnanya menjadi kuning, yang berarti hasil pengujian negatif. Pengujian seharusnya jangan dilakukan sebelum biakan berumur dua hari pada suhu 37^oC atau tiga hari pada suhu 30^oC. Metil merah berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6,2.

5.2 Cara Kerja

Langkah-langkah yang digunakan dalam uji methyl red  adalah :

Ø  disiapkan kaldu MR-VP, lalu dimasukkan 5 mL kaldu MR-VP dalam tabung reaksi dan diinokulasikan biakan bakteri ke dalam kaldu MR-VP

Ø   diinkubasi pada suhu 37^oC selama 48 jam atau pada suhu 30^oC selama 72 jam.  

Ø  Setelah 72 jam, ditambahkan reagen metil merah 5 tetes.

Ø  Diperhatikan perubahan yang terjadi

5.3 Pembacaan hasil

 -uji positif jika kaldu berwarna merah setelah penambahan reagen metil merah maka menunjukan hasil uji positif

- uji negatif jika warna kaldu berwarna kuning

6. Uji Amilolitik (Uji Hidrolisis pati)

6.1. Dasar teori

Amilum atau yang biasa disebut dengan pati adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel (Burrow, 1963). Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.

Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral.

6.2. Cara Kerja :

Untuk melakukan uji amilolitik ini maka perlu dilakukan beberapa langkah :

· Diinokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan sample bakteri misalnya Bacillus sp. secara streak.

· diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37^oC

· Setelah selesai inkubasi, ditetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena.

6.3.Pembacaan hasil

●hasil positif jika hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni setelah penambahan larutan iodin

●hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam yang menandakan tidak ada enzim amilase yang diproduksi untuk menghidrolisis pati.

7.    Uji Katalase

7.1. Dasar teori

Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida (H₂O₂), bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. Reaksi yang berlangsung yaitu :

Kebanyakan bakteri menggunakan enzim katalase untuk  memecahkan H₂O₂  menjadi H₂O dan O₂. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan bakteri aerobik karena H₂O₂ yang dihasilkan dengan bantuan berbagai enzim pernafasan bersifat racun/toksik bagi bakteri tersebut. Mekanisme enzim katalase memecah H₂O₂ yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H₂O₂. Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H₂O₂ dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H₂O₂ yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan memecah H₂O₂ menjadi H₂O dan O₂ dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen sedangkan pada bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal ini berarti H₂O₂ yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri tersebut sehingga tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim katalase yang menguraikan H₂O₂.

7.2 Cara kerja

1. Mengambil kultur sampel dengan ose secara aseptis dari agar miring dengan memijarkan ose dan mendinginkannya.

2. Biakan digoreskan pada cawan petri yang bertujuan untuk meratakan sel dan tidak bertumpuk.

3. Kultur mikroba kemudian ditetesi 1-2 tetes H₂O₂ 3% agar aktivitas katalase pada mikroba dapat diketahui.

4. Cawan petri ditutup kembali agar tidak ada kontaminasi dan memaksimalkan mikroba untuk merombak H₂O₂.

5. Diamati ada tidaknya gelembung-gelembung kecil.

7.3 pembacaan hasil

Ø  Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung oksigen di sekitar koloni bakteri

Ø  Uji negatif ditandai dengan tidak terbentuknya  gelembung-gelembung oksigen di sekitar koloni bakteri.

8.Uji Oksidase

8.1.Dasar teori

Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif.

8.2 Cara kerja

Ø  Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass.

Ø  Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas.

Ø  ditetesi dengan reagen, lalu dilihat perubahan yang terjadi

8.3 Pembacaan hasil

- hasil uji positif jika warna berubah menjadi biru marun (hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi).

-hasil uji negatif bila tidak terjadi perubahan warna maka . Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.

9. Uji Protease

9.1 Dasar Teori

Banyak bakteri heterofik dapat menghancurkan protein di luar tubuhnya dan menggunakan produk-produk hasil proses tersebut sebagai sumber tenaga karbon dan Nitrogen. Karena molekul protein terlampau besar untuk melewati membran, bakteri mengekskresikan eksoenzim yang disebut protease yang menghidrolisis protein tersebut menjadi peptida-peptida.

Uji protease bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba yang dapat menghasilkan enzim protease atau mikroba yang dapat menghidrolisis protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida-peptida kecil dan dari peptida-peptida kecil menjadi asam amino

9.2 cara kerja

Ø  Diinokulasi biakan pada media LA yang mengandung susu skim pada cawan Petri  dengan membagi media menjadi 4 bagian dengan menggunakan spidol pada bagian luar cawan petri,

Ø  digoreskan inokulum pada 4 bagian media tersebut

Ø  diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan suhu 37^oC

Ø  diamati zona yang terbentuk

9.3 Pembacaan hasil

Ø  uji positif jika terbentuk terbentuk zona bening di sekitar daerah goresan

Ø  uji negatif jika tidak terbentuk zona bening.

10.  Uji Reduksi Nitrat

10.1.Dasar teori

Untuk sederetan bakteri anaerob fakultatif  nitrat dapat berfungsi sebagai akseptor  hidrogen terminal untuk proses transport elektron yang menghasilkan energi. Reduksi nitrat oleh nitrat reduktase A menjadi nitrit yang tergandeng pada transport elektron untuk transformasi energi. Pada reaksi ini nitrit dapat tertimbun dalam larutan biak dan tidak terjadi pembentukan N₂. Sebagai gantinya, nitrit dapat direduksi menjadi amonium melalui melalui jalur asimilatorik reduksi nitrat dan selanjutnya diekskresi.

10.2.Cara kerja

Ø  Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme pada media nitrat  dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham

Ø  diinkubasi pada suhu 35^oC selama 24 jam.

Ø  Setelah masa inkubasi, diperhatikan adanya gas dalam tabung Durham dan nitrit dalam media biakan.

Ø  Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan  α-naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda. Pada tabung yang tidak menunjukkan perubahan warna, ditambahkan bubuk  Zn untuk melihat reduksi nitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu berubah warna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitrit dan nitrit ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah.

10.3.Pembacaan hasil

·   Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau merah muda setelah penambahan reagen uji, yang menunjukkan nitrat telah tereduksi menjadi nitrit. Dan jika terbentuk gelembung gas pada tabung Durham, hal ini menunjukkan nitrit tereduksi menjadi gas nitrogen. Sedangkan uji negatif memberikan hasil uji yang sebaliknya yakni tidak terjadi perubahan warna dan tidak terbentuk gas

                    NO₃^-  +  2e^-  +  2 H⁺   + H₂O

                                    2NO₂^-  +  7e^- + 8 H⁺    N_2(g) + 4 H₂O

11.  Uji Indol

11.1. Dasar teori

Uji indol bertujuan untuk menentukan kemampuan bakteri dalam memecah asam amino triptofan. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yamg terdapat di dalam protein sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Hasil uji indol yang diperoleh negatif apabila tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri tidak dapat membentuk indol dari asam amino triptofan sebagai sumber energi sedangkan pada uji positif bakteri memiliki enzim triptofanase yang dapat menghidrolisis asam amino jenis triptofan yang memiliki gugus samping indol sehingga indol akan bereaksi dengan reagen uji dan membentuk rosindol yang berwarna merah, seperti terlihat dalam reaksi

11.2. Cara kerja

Ø      Medium tripton cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL

Ø      diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35^oC, kemudian

Ø      ditambahkan beberapa tetes reagen Kovacs

Ø      diperhatikan warna yang terbentuk pada media

11.3.Pembacaan hasil

-Uji positif yang ditandai dengan terbentuknya warna merah pada kaldu media biakan

-Uji negatif apabila tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah.

12. Uji sitrat

12.1.Dasar teori

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini digunakan medium Simmon’s citrate agar yang merupakan medium sintetik dengan trinatrium sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon,  amonium (NH₄⁺) sebagai sumber nitrogen dan brom timol  biru sebagai indikator pH. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH  dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, sedangkan pada medium sitrat koser kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan mikroba.

                          Na⁺  +  H₂PO₄^-   NaH₂PO₄

                                                                                ^{natrium dihidrogen fosfat}

              Gambar . Penggunaan sitrat oleh bakteri.

Dalam medium Simmon’s citrate agar (SCA digunakan trinatrium sitrat sebagai sumber karbon. Bila trinatrium sitrat ini dapat diuraikan maka amonium dihidrogenfosfat turut teruraikan dan akan melepaskan NH₄⁺ sehingga menyebabkan medium menjadi alkalis, dan indikator brom timol biru berubah dari hijau menjadi biru.

12.2.Cara kerja

Ø  Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar dengan inokulum yang tipis

Ø  diinkubasi pada suhu 35⁰C selama 48 jam.

Ø  diamati perubahan warna yang terjadi.

12.3 Pembacaan hasil

Ø  positif jika warna biakan berubah menjadi biru

Ø  negatif jika warna biakan tetap hijau

13.  Uji Selulase

        Dasar teori

Selulosa merupakan komponen dasar dari bahan-bahan asal tumbuhan dan produksi selulosa melampaui semua zat-zat alamiah lain. Selulosa berbentuk polimer tak bercabang dari glukosa yang dihubungkan melalui ikatan 1,4-β glikosida. Molekul lurus dengan unit glukosa rata-rata sebanyak 5000 ini beragregasi membentuk fibril yang terikat melalui ikatan hidrogen di antara gugus hidroksil pada rantai di sebelahnya. Serat selulosa yang mempunyai kekuatan fisik yang tinggi terbentuk dari fibril-fibril ini tergulung seperti spiral dengan arah-arah yang berlawanan menurut satu sumbu .

Pecahan enzimatik selulosa dilakukan ole enzim selulase. Enzim selulase  merupakan  enzim  inducible, yaitu enzim yang dihasilkan sebagai respon terhadap jenis makanan yang terdapat di dalam lingkungan pertumbuhan organisme penghasilnya. Enzim ini merupakan suatu kompleks enzim yang bekerja bersama-sama atau bertahap dalam menguraikan selulosa menjadi unit glukosa. Tiga jenis reaksi yang dikatalisis oleh selulase : 1). Memotong interaksi nonkovalen dalam bentuk ikatan hidrogen yang ada dalam struktur kristal selulosa oleh enzim endo-selulase, 2). Hidrolisis serat selulosa menjadi sakarida yang lebih sederhana oleh ekso-selulase, 3). Hidrolisis disakarida dan tetrasakarida menjadi glukosa  oleh enzim β-glukosidase.

        Cara kerja

Ø  Inokulasi biakan pada media Luria agar (LA) yang mengandung CMC (karboksimetilselulase) pada cawan Petri  dengan melubangi agar pada cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang

Ø  diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian dimasukkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet

Ø  diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 mL

Ø  diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37^oC.

Ø  diamati perubahan yang terjadi

        Pembacaan hasil

Ø  Positif jika terbentuk zona bening di sekitar daerah pertumbuhan bakteri

Negatif jika tidak terbentuk zona bening di sekitar daerah pertumbuhan bakteri.

14.  Uji urease

        Dasar teori

Urease merupakan salah satu bentuk enzim yang berperan dalam proses perkecambahan. Enzim urease memiliki substrat spesifik yaitu urea. Enzim ini dapat mengkatalis reaksi pemecahan urea yang bersifat patogen dalam sel tumbuhan menjadi amonia dan CO₂.

(NH₂)₂CO      CO₂ + 2NH₃

Reaksi enzimatis yang melibatkan enzim urease tergolong ke dalam reaksi hidrolisa dimana aktivitasnya dipengaruhi oleh adanya air. Medium yang digunakan dalam uji ini adalah kaldu urea yang merupakan larutan ekstrak khamir dan urea yang diberi larutan penyangga. Medium tersebut juga mengandung merah fenol sebagai indikator pH. Bila mikroba yang diidentifikasi menghasilkan urease, maka amonia yang dilepaskan ke dalam medium akan menaikan pH. Bila pH menjadi makin tinggi maka merah fenol akan berubah warna dari kuning menjadi merah keunguan .

        Cara kerja

Ø  Inokulasi biakan pada media urea agar miring dengan mikroorganisme

Ø  diinkubasi pad suhu 35⁰C selama 24  jam.

Ø  Diamati perubahan yang terjadi

14.3. pembacaan hasil

Ø  Positif jika terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan

Ø  Negatif jika tidak terjadi perubahan warna.

15.  Uji  pencairan gelatin

            Dasar teori

Gelatin adalah protein yang diperoleh ketika proses merebus tulang rawan atau jaringan ikat hewan lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk gel. Beberapa mikroorganisme tertentu mampu menghasilkan enzim gelatinase yang dapat menguraikan molekul gelatin menjadi peptida-peptida kecil penyusun gelatin tersebut, sehingga peptida-peptida yang dihasilkan dari proses penguraian tersebut dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin oleh mikroorganisme dikatalisasikan oleh enzim gelatinase. Gelatin yang telah  dicerna oleh mikroba tidak dapat membentuk gel dan akan berwujud cair.

Gelatin peptida-peptida kecil

        Cara kerja

Ø  Biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yang akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan

Ø  diinkubasi pada suhu 35⁰C selama 24 jam.

Ø  Jika media gelatin mencair, maka langkah selanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit. Diamati pencairan gelatin, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika tidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 35⁰C. Uji negatif jika setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun.

            Pembacaan hasil

Ø  Positif jika gelatin mencair setelah diinkubasi

Ø  Negatif jika gelatin tidak mencair setelah satu minggu.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-9-aktivitas-enzimatis.html

Akses 29 Nopember 2009.

Anonim.http://hafizluengdaneun.multiply.com/journal/item/1/Laporan_Koasistensi_    

Mikrobiologi_. Akses 29 Nopember 2009.

Anonim.http://Dedy’s site.blogspot/uji-biokimia-mikroba.akses 29 Nopember 2009.

Pelczar, michael j dan E.c.s.chan.2008.Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Erlangga.

Schlegel, hans dan Karin scmidt. 1994. Mikrobiologi Umum.Yogyakarta : UGM Press.